高熳熳，胡江南，马立娟，杜丽平*，田晓菊，张惠玲，杨伟明
（1.天津科技大学 生物工程学院，天津 300457；
2.宁夏大学 食品与葡萄酒学院，宁夏 银川 750021；
3.宁夏志辉源石葡萄酒庄有限公司，宁夏 银川 750026）
葡萄汁发酵成葡萄酒是一个复杂的生化过程。过去，酿酒师常利用商业酵母进行纯种发酵，虽然可避免发酵迟缓或停滞的风险，但不能很好地体现葡萄酒的复杂性和典型性[1]。为了改善葡萄酒的风味概况和地域风格，满足不同风格和复杂程度的葡萄酒产品市场要求，一些能够体现“地域特色”的本土非酿酒酵母菌（non-Saccharomyces cerevisiae）被应用于葡萄酒发酵中。
毕赤克鲁维酵母（Pichia kluyveri）作为非酿酒酵母中最受关注的菌种之一，在提高葡萄酒花香及果香特征方面具有极大的应用潜力[2]。但因其酒精耐受力差，往往不能单独完成酒精发酵，因此常将其与酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）混合发酵来提高葡萄酒的品质。DUTRAIVE O等[3]研究发现，将P.kluyveri与酿酒酵母混合发酵葡萄酒可显著提高葡萄酒的总酯、甘油和戊酸浓度；
GE Q等[4]研究发现，P.kluyveri可显著增加葡萄酒芳樟醇、对二甲苯和橙花醇氧化物的含量。因此将具有优良酿酒特性的本土非酿酒酵母与酿酒酵母混合发酵有助于体现葡萄酒的产区或地域典型性，对于避免产品同质化、获得高品质葡萄酒，具有广阔的应用前景。
本研究以‘赤霞珠’葡萄为原料，以分离筛选于宁夏银川红寺堡产区的优良本土毕赤克鲁维酵母和商业酿酒酵母作为发酵剂，探究混菌发酵对葡萄酒理化特性和香气成分的影响，以期为发掘具有地域特性的优良菌株及建立多菌种发酵工艺模式提供技术参考。
1.1 材料与试剂
‘赤霞珠’葡萄：于2021年10月3日购买于宁夏银川，还原糖含量为280 g/L，可滴定酸（以酒石酸计）含量为4.98 g/L，pH 3.58。
毕赤克鲁维酵母：筛选于宁夏银川红寺堡产区赤霞珠葡萄表皮。酿酒酵母：法国LAMOTHE ABIET公司。
酵母浸粉：北京奥博星生物技术有限公司；
蛋白胨（分化试剂）：天津市英博生化试剂有限公司；
葡萄糖（分析纯）：天津市永大化学试剂开发中心；
琼脂粉（分化试剂）：北京索莱宝科技有限公司；
氯化钠（分析纯）：天津市北方化玻购销中心；
硫酸（分析纯）：天津市化学试剂一厂；
无水乙醇（色谱纯）：国药集团化学试剂有限公司；
4-甲基-2-戊醇（色谱纯）：上海安谱试验科技股份有限公司。
酵母浸出粉胨葡萄糖（yeast extract peptone dextrose，YPD）培养基：葡萄糖20 g/L，蛋白胨20 g/L，酵母浸粉10 g/L，自然pH，121 ℃高压蒸汽灭菌20 min。
1.2 仪器与设备
PL403台式离心机、S20 pH计：梅特勒-托利多仪器有限公司；
ZXJD-A1270超净工作台：上海智城分析仪器制造有限公司；
L-550恒温培养箱：湖南湘仪仪器开发有限公司；
50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取头：美国Supelco公司；
1100LC高效液相色谱仪（high performance liquid chromatography，HPLC）、7890B-7000D气相色谱-质谱联用仪（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）、CP-WAX 57 CB色谱柱（60 m×0.25 mm×0.4 μm）、顶空固相微萃取（headspace-solid phase microextraction technique，HS-SPME）装置：美国安捷伦科技有限公司。
1.3 方法
1.3.1 菌株活化
将毕赤克鲁维酵母接种于YPD液体培养基中，28 ℃活化培养24 h，再重复活化一次，培养至对数生长期。酿酒酵母按照产品说明进行活化。
1.3.2 发酵试验
‘赤霞珠’葡萄除梗破碎后分装于三角瓶中，70 ℃灭菌15 min。将活化好的菌株6 000 r/min离心5 min后收集菌体，经0.9%的生理盐水洗涤两次后接入三角瓶中。毕赤克鲁维酵母接种量为107CFU/mL，酿酒酵母的接种量为106CFU/mL，接种方式为顺序接种，即先接种非酿酒酵母，48 h后再接种酿酒酵母，以毕赤克鲁维酵母和酿酒酵母单独发酵为对照（其中Mix表示毕赤克鲁维酵母与酿酒酵母混合发酵，Sc、Pk分别表示酿酒酵母、毕赤克鲁维酵母单独发酵），于25 ℃条件下静置发酵，通过每天测定CO2质量损失监测发酵进程，若连续两天的质量变化＜0.2 g，则认为发酵结束。发酵结束后将酒样10 000 r/min离心10 min，上清液用于后续分析，每个试验重复3次。
1.3.3 测定方法
总糖、总酸、pH、挥发酸等：参照GB/T15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》测定；
酒精度：参照GB 5009.225—2016《食品安全国家标准酒中乙醇浓度的测定》。
甘油含量的测定：参照高莹莹等[5]的方法。色谱柱为Bio-Rad HPX-87H（300 mm×7.8 mm）；
检测器为示差折光检测器（refractive index detector，RID）；
流动相为5 mmol/L稀硫酸，流速为0.6 mL/min；
检测器温度45 ℃，柱温65 ℃，进样量20 μL。每个样品重复3次。
有机酸含量的测定：使用高效液相色谱仪[6]（紫外检测器）测定有机酸的含量。色谱柱为Aminex HPX-87H色谱柱（300 mm×7.8 mm），流动相为5 mmol/L稀硫酸，流速0.6 mL/min，柱温60 ℃，进样体积20 μL，检测波长为210 nm。每个样品重复3次。
挥发性成分测定：采用顶空固相微萃取-气相色谱-质谱联用（HS-SPME-GC-MS）技术对葡萄酒香气成分进行检测。
HS-SPME条件：取发酵样品8 mL置于20 mL顶空瓶中，加入2.5 g NaCl和10 μL 4-甲基-2-戊醇（内标，2.055 g/L），60 ℃平衡15 min，萃取45 min。
GC-MS条件：CP-WAX 57 CB 色谱柱（60 m×0.25 mm×0.4 μm），萃取头在进样口200 ℃解吸5 min，采用不分流模式进样，载气为氦气（＞99.99%），流速为1.0 mL/min，程序升温：初始温度40 ℃，保持2 min，以2 ℃/min升至100 ℃，以4 ℃/min升至190 ℃，保持5 min，总运行时间59.5 min。质量选择检测器（mass selective detector，MSD）传输线250 ℃，质谱选择SCAN模式进行扫描。质谱结果利用美国国家标准与技术研究院（national institute of standards and technology，NIST）14谱库进行各挥发性物质的定性，采用内标法进行定量。
1.3.4 葡萄酒感官评价
葡萄酒感官品评小组由10名（5名男性，5名女性）天津科技大学葡萄酒专业老师和学生组成，每位品尝员均经过专业品评培训，分别从浓郁度、果香味、花香味、余味、生青味、酸味这6个方面对酒样进行评价，以8分结构数值量化为标准。感官分析过程中，每一供试酒样重复分析3次。
1.3.5 数据统计分析
采用Microsoft Office 2016软件进行数据统计；
SPSS 23.0软件对不同发酵处理酒样的理化指标及挥发性香气成分进行单因素方差分析，邓肯法（Duncan）进行事后多重比较，P＜0.05表示差异显著；
用Origin 2021软件作图。
2.1 不同发酵组发酵动力学曲线
不同发酵组发酵动力学曲线见图1。由图1可知，酿酒酵母单独发酵组（Sc）的起酵速度比混合发酵组（Mix）快。与毕赤克鲁维酵母（Pk）单独发酵相比，接种酿酒酵母使混合发酵组（Mix）发酵速度加快。Sc组和Mix组都在第9天完成发酵，发酵结束时，Sc组释放15.53 g CO2，Mix组释放17.13 g CO2。而Pk组发酵速度缓慢，到后期停止发酵，说明其发酵能力较弱，不能单独完成酒精发酵。
图1 不同发酵组发酵动力学曲线Fig.1 Fermentation kinetics curves of different fermentation groups
2.2 葡萄酒基本理化指标分析
不同发酵组酒精发酵结束后酒样的基本理化指标见表1。由表1可知，Sc组和Mix组酒样中残糖含量为3.58 g/L、1.61 g/L，均低于4 g/L；
酒精含量为12.33%vol、12.08%vol，说明Sc组和Mix组均完成了酒精发酵，且两组之间残糖含量和酒精含量无显著差异。而Pk组的残糖含量较高，为74.00 g/L；
酒精含量仅为6.46%vol，是因为其不能独立完成酒精发酵，未能充分利用糖，与其他两组差异显著。葡萄酒的pH值一般为2.8～3.8，过高容易遭到微生物的侵害，过低则葡萄酒的口感较为酸涩，本试验中3个酒样的pH值均在此范围内。挥发酸是由微生物产生的腐败代谢产物之一，其含量过高会给葡萄酒带来一定负面影响[7]。目前国内外都对葡萄酒中的挥发酸含量作出了严格规定，GB 15037—2006《葡萄酒》对干红葡萄酒挥发酸含量的要求是≤1.2 g/L（以醋酸计），试验中发现，与Sc组相比，Pk组和Mix组酒样的挥发酸含量增加明显（P＜0.05），但均在标准范围内，说明该株毕赤克鲁维酵母产挥发酸的能力较强。
表1 不同发酵组‘赤霞珠’葡萄酒基本理化指标Table 1 Basic physicochemical indexes of "Cabernet Sauvignon"wine in different fermentation groups
2.3 甘油含量分析
甘油（glycerol）是酵母酒精发酵的主要副产物之一，通过酵母的糖代谢途径产生，具有一定的甜味，可使葡萄酒口感圆润，并增加口感的复杂性。如图2所示，与Sc组相比，Pk组和Mix组酒样的甘油含量增加明显（P＜0.05），尤其是Mix组，甘油含量增加了3.06 g/L，说明毕赤克鲁维酵母产甘油能力较强，这与DUTRAIVE O等[3]的研究结果一致。
图2 不同发酵组‘赤霞珠’葡萄酒甘油含量Fig.2 Glycerol content of "Cabernet Sauvignon" wines in different fermentation groups
2.4 有机酸含量分析
葡萄酒中的有机酸可对葡萄酒的稳定性、陈酿特性和感官质量产生较大影响。不同发酵组酒精发酵结束后酒样的有机酸含量见表2。由表2可知，Sc组和Mix组的苹果酸含量无明显差别，而Pk组的苹果酸含量高于其他两组，这可能与毕赤克鲁维酵母未完成酒精发酵相关；
琥珀酸复杂的味感能够呈现葡萄酒的醇厚感，其中Sc组的琥珀酸含量最高，其次是Mix组和Pk组，说明混菌发酵并未对琥珀酸含量产生较大影响；
此外对于酒石酸和乳酸含量，三个发酵组无明显差异。
表2 不同发酵组‘赤霞珠’葡萄酒有机酸含量Table 2 Organic acid content of "Cabernet Sauvignon" wine in different fermentation groups
2.5 香气成分分析
葡萄酒品质与其挥发性香气成分密切相关[8]。不同发酵组的葡萄酒香气成分见表3。
由表3可知，在所有葡萄酒样中共检测分析出36种香气物质，其中包括16种醇类、13种酯类、3种酸类和4种醛酮类。
表3 不同发酵组‘赤霞珠’葡萄酒香气成分Table 3 Volatile compounds of "Cabernet Sauvignon" wine in different fermentation groups
续表
高级醇的含量对葡萄酒的品质具有较大影响，当其含量低于300 mg/L时能够使葡萄酒的香气更加丰富，但当其总含量超过400 mg/L时，就会给人带来强烈的刺鼻味和不悦感[20]。试验3个发酵组酒样中高级醇的含量分别为
85.74 mg/L、237.04 mg/L、285.44 mg/L，可对葡萄酒产生积极影响。接种毕赤克鲁维酵母则会使高级醇含量降低16.96%，这与夏鸿川等[21]的研究结果相符。同时，与Sc组相比，Mix组可以提高苯甲醇的含量，进而给葡萄酒带来甜味，且Mix组中苯乙醇含量占高级醇总量的47.39%，可给葡萄酒带来蜂蜜、玫瑰、丁香花等宜人香味。
酯类是葡萄酒果香的主要贡献者[22]。本试验酒样中鉴定出13种酯类物质，其中Mix组和Sc组共有8种达到其阈值，包括乙酸乙酯、乙酸异戊酯、己酸乙酯、辛酸乙酯、癸酸乙酯、丁二酸二乙酯、9-癸烯酸乙酯和十二烷酸乙酯。同时，与Sc组相比，Mix组可以显著提高乙酸乙酯（8.90倍）、乙酸异戊酯（1.38倍）和乙酸苯乙酯（1.81倍）含量。当乙酸乙酯含量超过150 mg/L时，可产生“指甲油去除剂”的异味，但本试验中Mix组乙酸乙酯含量为36.91 mg/L，可为葡萄酒带来甜味和水果香；
乙酸异戊酯可为葡萄酒增添果香和香蕉香，Mix组中乙酸异戊酯的含量远远超过其阈值；
乙酸苯乙酯是一种特殊的芳香化合物，当其含量超过0.25 mg/L时，能够给葡萄酒增添玫瑰花的芳香[23]，而Mix组中乙酸苯乙酯含量可达10.03 mg/L，说明毕赤克鲁维酵母的添加可为葡萄酒的香气作出重要贡献，这与WHITENER M E B等[24]的研究结果一致。此外，Pk组和Mix组中都产生了Sc组所没有的十六烷酸乙酯，其可为葡萄酒带来奶油香，丰富葡萄酒的香气成分。
葡萄酒的品质受酸类化合物的影响，其中对葡萄酒的香气起着重要贡献作用的是饱和脂肪酸，在其接近气味阈值时能够增加葡萄酒香气的丰富性。然而在过高的浓度下，会给葡萄酒带来“汗味”、“腐臭”和“脂肪”等气味[25]。Mix组辛酸含量下降，可减少其带来的黄油味和苦杏仁味。同时Mix组的苯甲醛和3,5-二甲基苯甲醛含量增加，为葡萄酒提供樱桃及蔷薇花香。
利用TBtools v1.0692软件对3个不同发酵处理的赤霞珠葡萄酒中香气成分进行热图聚类分析，探究不同发酵处理下赤霞珠葡萄酒中主要香气成分间差异。由图3可知，36种香气成分被聚为3类。
图3 不同发酵组‘赤霞珠’葡萄酒香气成分聚类分析热图Fig.3 Clustering analysis heat map of aroma components of"Cabernet Sauvignon"wine in different fermentation group
第一类香气成分主要是由毕赤克鲁维单独发酵产生的，包括2,3-丁二醇、乙酸乙酯、乙酸等9种物质，其中2,3-丁二醇、乙酸乙酯和乙酸异戊酯主要表现为果香和花香，但乙酸含量较高，影响了葡萄酒的风味。第二类香气成分主要是由酿酒酵母单独发酵产生的，包括异戊醇、苯乙醇、丁二酸二乙酯、9-癸烯酸乙酯等14种物质，其香气成分主要表现为花香、果香、奶油和脂肪的香气等，增加了葡萄酒香气的丰富性和愉悦性。其中苯乙醇含量显著高于Pk组和Mix组，其含量是其香气阈值的8.48倍，给葡萄酒带来了蜂蜜、玫瑰和丁香花的香气；
辛酸乙酯含量是其香气阈值的422倍，给葡萄酒带来了浓郁的果香。第三类香气成分在Mix组中含量较高，主要包括乙酸苯乙酯、苯甲醇等，其中乙酸苯乙酯含量显著高于Pk组和Sc组，可为葡萄酒带来热带水果、玫瑰和蜂蜜的香气。毕赤克鲁维的参与显著改变了葡萄酒的香气成分组成，其在葡萄酒整体香气形成中的作用有待深入研究。
2.6 感官分析
各试验组酒样的感官分析雷达图（图4）表明，Mix组的余味、浓郁度、果香和花香得分均高于Sc组，显著高于Pk组（P＜0.05）。这是因为毕赤克鲁维酵母与酿酒酵母混合发酵后显著增加了葡萄酒中酯类物质的含量（P＜0.05），尤其是乙酸乙酯和乙酸苯乙酯，赋予了葡萄酒浓郁的花香和果香。而毕赤克鲁维酵母由于不能单独完成酒精发酵，感官得分较低。综上，毕赤克鲁维酵母与酿酒酵母共接种发酵有利葡萄酒品质的提升。
图4 不同发酵组‘赤霞珠’葡萄酒感官分析雷达图Fig.4 Sensory analysis radar map of "Cabernet Sauvignon" wine in different fermentation groups
本实验选用‘赤霞珠’葡萄为原料，毕赤克鲁维酵母和酿酒酵母为发酵剂，目的在于研究本土毕赤克鲁维酵母对‘赤霞珠’葡萄酒相关酿酒参数、香气成分和感官特性的影响。研究发现，本土毕赤克鲁维酵母和酿酒酵母混合发酵能够增加葡萄酒的甘油含量，同时增加葡萄酒酯类挥发性香气物质的含量，尤其是乙酸乙酯、乙酸异戊酯和乙酸苯乙酯，给葡萄酒带来较多的花香。感官评价结果也表明混合发酵的葡萄酒果香味和花香味较为浓郁，口感较好。综上，本土毕赤克鲁维酵母有利于提升葡萄酒品质。后续可进一步对工艺参数进行优化，为生产具有地域特色的优质葡萄酒提供参考依据。
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